盤(pán)龍七片調(diào)節(jié)骨保護(hù)素/核因子kB受體活化因子配體信號(hào)通路對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的影響
盤(pán)龍七片可能通過(guò)抑制RANKL水平，上調(diào)OPG表達(dá)，改善去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松癥狀。
骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種全身性骨代謝疾病，其主要特征是骨量減少、骨組織細(xì)微結(jié)構(gòu)退化、骨強(qiáng)度降低，其潛在機(jī)制是骨骼吸收與骨骼成骨之間的不平衡，表現(xiàn)為骨脆性及骨折危險(xiǎn)性增加。
研究表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)是骨質(zhì)疏松癥最常見(jiàn)的一種，絕經(jīng)后老年女性的骨質(zhì)疏松發(fā)病率高達(dá)49％，常因輕度暴力或非創(chuàng)傷因素而導(dǎo)致脆性骨折。
骨保護(hù)素(OPG)、核因子-kB受體活化因子配體(RANKL)是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，OPG/RANKL信號(hào)通路在骨代謝的骨吸收過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，能影響破骨細(xì)胞在骨重構(gòu)中生成、分化、成熟和功能的激活。
盤(pán)龍七片是一種中成藥，臨床上對(duì)不同的骨科疾病具有明顯的臨床療效，調(diào)節(jié)骨代謝，改善骨科疾病。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病與“血瘀”有關(guān)，并將其歸于“骨痹”“骨痿”等范疇。盤(pán)龍七片有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、強(qiáng)筋壯骨的作用，恰好切中“骨痹”之要害。已有研究發(fā)現(xiàn)，盤(pán)龍七片在對(duì)骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折患者術(shù)后恢復(fù)的治療過(guò)程中具有顯著作用。
因此，本研究通過(guò)建立去卵巢大鼠模型探究盤(pán)龍七片對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的藥效作用以及對(duì)股骨組織中 OPG/RANKL信號(hào)通路的影響。
1.材料與方法
1.1.動(dòng)物
實(shí)驗(yàn)所用大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,75只雌性 SD(Sprague Dawley)大鼠,4個(gè)月齡,SPF級(jí),體質(zhì)量(338.26±20.48)g,所有大鼠均在動(dòng)物房中飼養(yǎng),保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、通風(fēng),12h的光/暗周期,溫度(24±2)℃,相對(duì)濕度為58％±2％,自由獲取飼料和飲水。
1.2.主要試劑及儀器
盤(pán)龍七片(國(guó)藥準(zhǔn)字Z61020050,陜西盤(pán)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)等。
雙能X線(xiàn)骨密度分析儀(美國(guó)NORLAND公司)；光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse80i,日本)；MX-0580-骨科生物力學(xué)測(cè)試儀(中國(guó)上海衡翼精密儀器有限公司)等。
1.3.方法
1.3.2.給藥處理 造模完成24h后,假手術(shù)、模型組皮下注射10mL/kg0.9％生理鹽水,陽(yáng)性藥組(1mg/kg)每天皮下注射10mL/kg 17β-雌二醇(0.1mg/mL)；盤(pán)龍七片換算設(shè)置低(0.26g/kg)、高劑量組(1.29g/kg)，并用生理鹽水配置為0.026,0.129g/mL混懸液以10mL/kg的劑量灌胃給藥，1次/d，持續(xù)給藥8周。
1.3.3.大鼠存活情況 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中,各組大鼠存在不同數(shù)量的死亡,最后,假手術(shù)組納入實(shí)驗(yàn)15只,模型組13只,陽(yáng)性藥物組14只,低劑量組14只,高劑量組15只。
1.3.4.樣本采集 骨密度測(cè)完后,用酒精和碘伏消毒手術(shù)部位,開(kāi)腹,腹主動(dòng)脈采血,1500r/min離心15min,取上層血清,取出大鼠左后肢股骨,滅菌后-70℃保存。
1.3.5.骨密度測(cè)定 各組大鼠左后肢離體股骨平置于雙能X線(xiàn)骨密度平臺(tái)上測(cè)定左股骨部位骨礦含量。
1.3.6.骨生物力學(xué)檢測(cè) 左側(cè)股骨放在生物力學(xué)萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)機(jī)上,壓頭以2mm/min速度下降,直至股骨斷裂。采集數(shù)據(jù)并繪制載荷-變形曲線(xiàn),測(cè)得******撓度、彈性載荷、彈性撓度,計(jì)算出******載荷和彈性模量。
1.3.7.HE染色 左側(cè)股骨遠(yuǎn)端用含10％福爾馬林的乙二胺四乙酸溶液(EDTA)脫鈣4周后石蠟包埋。將石蠟包埋的股骨組織切成4μm切片的標(biāo)本進(jìn)行HE染色。用光學(xué)顯微鏡對(duì)染色的股骨進(jìn)行觀(guān)察和成像。
1.3.8.血清中骨代謝標(biāo)志物β-CTX、BALP濃度 檢測(cè)各組動(dòng)物血清中血清β-膠原降解產(chǎn)物(β-CTX)、骨堿性磷酸酶(BALP)含量等指標(biāo),具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
2.結(jié)果
2.1.盤(pán)龍七片對(duì)去卵巢大鼠骨密度的影響
各且大鼠左后肢離體股骨骨密度比較見(jiàn)表1，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠BMC顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組相比，陽(yáng)性藥物組、低劑量組、高劑量組BMC含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與陽(yáng)性藥物組相比，低劑量組BMC較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，高劑量組BMC較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
2.2.盤(pán)龍七片對(duì)去卵巢大鼠骨生物力學(xué)特性的影響
各組大鼠左后肢離體股骨生物力學(xué)特性比較見(jiàn)表2，與假手術(shù)組相比，模型組******載荷與彈性模量均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）；與模型組相比，陽(yáng)性藥物組、低劑量組、高劑量組******載荷與彈性模量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與陽(yáng)性藥物組相比，低劑量組******載荷與彈性模量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高劑量組******載荷與彈性模量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
2.3.盤(pán)龍七片對(duì)去卵巢大鼠骨組織形態(tài)的影響
HE染色檢測(cè)大鼠左股骨病理?yè)p傷見(jiàn)圖1。與假手術(shù)組相比，模型組左側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨小梁稀疏、結(jié)構(gòu)不完整、明顯變薄、排列紊亂，存在大量空骨陷窩，骨小梁連通性喪失，骨小梁間隙增寬；與模型組相比，低劑量組左側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨小梁有所改善，陽(yáng)性藥物組與高劑量組左側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改善，骨小梁結(jié)構(gòu)完整，空骨陷窩減少，骨小梁排列更加整齊，高質(zhì)量組恢復(fù)************。
3.討論
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理機(jī)制復(fù)雜，尚無(wú)有效、安全的治療方法。西藥主要采用骨吸收抑制劑(雌激素)、骨形成和骨礦化促進(jìn)劑等治療手段。但這些藥物長(zhǎng)期服用會(huì)引發(fā)一系列不良反應(yīng)，如血栓形成、冠心病及乳腺癌等。中醫(yī)藥的方法治療骨科疾病是醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。
3.討論
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理機(jī)制復(fù)雜，尚無(wú)有效、安全的治療方法。西藥主要采用骨吸收抑制劑(雌激素)、骨形成和骨礦化促進(jìn)劑等治療手段。但這些藥物長(zhǎng)期服用會(huì)引發(fā)一系列不良反應(yīng)，如血栓形成、冠心病及乳腺癌等。中醫(yī)藥的方法治療骨科疾病是醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。
本研究建立去卵巢動(dòng)物模型，首先探討盤(pán)龍七片對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響，結(jié)果顯示模型組大鼠BMC、******載荷與彈性模量顯著降低，HE染色結(jié)果顯示，模型組左側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨小梁稀疏、結(jié)構(gòu)不完整、明顯變薄、排列紊亂，說(shuō)明去卵巢后骨組織明顯受損嚴(yán)重，與李永賢等構(gòu)建去卵巢大鼠模型后骨組織組織結(jié)構(gòu)染色結(jié)果相一致，表明骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功。給予盤(pán)龍七片治療后，大鼠BMC含量、******載荷與彈性模量明顯升高，低劑量組左側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨小梁有所改善，陽(yáng)性藥組與高劑量組左側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)均明顯改善，且高質(zhì)量組恢復(fù)************，說(shuō)明盤(pán)龍七片能顯著提高骨密度，提示盤(pán)龍七片有利于緩解大鼠的骨質(zhì)疏松狀況。
PMOP是由于體內(nèi)卵巢功能降低，引起骨偶聯(lián)過(guò)程RANKL和OPG蛋白分泌失衡，骨吸收超過(guò)骨形成，從而導(dǎo)致凈骨量減少，骨脆性增加，骨強(qiáng)度降低。研究表明多數(shù)中西藥對(duì)去卵巢后骨質(zhì)疏松大鼠的治療機(jī)理都與OPG/RANKL通路有關(guān)。吳彬等研究發(fā)現(xiàn)雌馬酚能有效改善去卵巢后大鼠骨質(zhì)疏松癥，可能與其能上調(diào)OPG而抑制RANKL分泌有關(guān)。顏春魯?shù)劝l(fā)現(xiàn)地黃飲子可能通過(guò)調(diào)控 OPG/RANKL/RANK 信號(hào)通路發(fā)揮抗去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的作用。
本研究中，去卵巢后模型組大鼠骨組織OPG蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組顯著下降，RANKL蛋白水平顯著上調(diào)，RANKL與OPG之間失衡，從而導(dǎo)致大鼠骨形成與骨吸收失衡，發(fā)生骨質(zhì)疏松。給予盤(pán)龍七片治療后，陽(yáng)性藥物組、低劑量組、高劑量組大鼠骨組織較模型組OPG蛋白表達(dá)水平顯著上升，RANKL蛋白水平顯著下降且高劑量組大鼠骨組織OPG蛋白表達(dá)水平最高，RANKL蛋白表達(dá)水平最低，說(shuō)明盤(pán)龍七片能夠上調(diào)骨保護(hù)相關(guān)蛋白合成，促進(jìn)骨形成作用，且效果優(yōu)于陽(yáng)性藥物，提示盤(pán)龍七片可能通過(guò)調(diào)控OPG/RANKL通路改善去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松。
綜上所述
RANKL/OPG信號(hào)通路激活與PMOP病理過(guò)程有密切關(guān)系，盤(pán)龍七片可能通過(guò)抑制RANKL表達(dá)，促進(jìn)OPG表達(dá)，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，進(jìn)而減輕骨質(zhì)疏松程度，可能為臨床上利用盤(pán)龍七片對(duì)PMOP治療提供了理論參考，但盤(pán)龍七片調(diào)控OPG/RANKL信號(hào)通路的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。
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